பக்டிரியல் படிவாக்கம்

பக்டிரியல் படிவாக்கம் (bacterial cloning) என்னும் நுட்பம் மூலக்கூற்று உயிரியலின் ஒரு அடிப்படை நுட்பமும், தலையாய முறையுமாகும். ஒரு புரதத்தை மிகைப்படுத்த வேண்டும் என்றாலும் (எ.கா: தீ நுண்ம தடுப்பு மருந்துகள், viral protein அல்லது protein sub-unit vaccines) அல்லது மரபணு மாற்றப்பட்ட தாவரங்களை உருவாக்க வேண்டும் என்றாலும் இந்நுட்பத்தை பயன்படுத்தியே ஆக வேண்டும். மேலும் புரதங்களுக்கு இடையே நடைபெறும் இணைவாக்கம், தொடரூக்கி ஆய்வுகள் (promoter studies) என எவ்வித மூலக்கூறு உயிரியலின் ஆய்வும், இம்முறையைத் தொடாமல் செல்வதில்லை.

பக்டிரியல் படிவாக்கமும் அதன் பின் மாற்றியமைக்கப்பட்ட கணிமியெய் பிரித்தெடுக்கும் முறையும் விளக்கும் படம். நன்றி:Bio-davidson.edu/course

பக்டிரியல் படிவாக்கத்தில் (படியெடுப்பு) பல முறைகள் உள்ளன. பி.சி.ஆர். படிவாக்கம், உள்-பிணைவு படிவாக்கம் (In-fusion cloning) என்ற முறைகளும் உள்ளன.

மேலும் கட்டுள்ள நொதிகளின் செரித்தல் அல்லது வெட்டுதலைப் (restriction enzyme digestion) பொருந்து இரு வகையான படிவாக்கங்கள் உள்ளன.

• ஒற்று முனை படிவாக்கம் (blunt end cloning)
• ஒற்று -அற்ற முனை படிவாக்கம் (sticky end cloning)

ஒற்று முனை படிவாக்கம்

பொதுவாக குறிப்பிட்ட கட்டுள்ள நொதிகள் ஒரு குறிப்பிட்ட பகுதியில் டி.என்.எ க்களை வெட்டும் அல்லது செரிக்கும் பொழுது, இரு வகையான முனைகளை ஏற்படுத்த வல்லன. எடுத்துகாட்டாக SmaI, ( இங்கு sma என்பது Serratia என்னும் நுண்ணுயிரில் இருந்து பிரிக்கபட்டதாகும்) வின் வெட்டும் பகுதி 5'-C C C^G G G-3', இவ்விடத்தில் அம்பு குறியிட்ட இடத்தில் வெட்டுவதால், பிரிக்கப்படும் டி.என்.எ ஒற்று முனையெய் (blunt, மட்டுப்படுத்தப்பட்ட முனை) கொண்டு இருக்கும். படிவாக்கம் செய்யப்படும் டி.என்.எ , இரு வழிகளில் (நேரான அல்லது தலைகீழ், orientation, sense or anti sense ) படிவாக்கப்படும். மேலும் இம்முறையில் தன்-இணைவு (self-ligation) மிகையாக இருப்பதால், பல பல்கலன்களை (colony) தேர்ந்தெடுந்து படிவாக்கம் செய்த டி.என்.எ உள்ளதா? இல்லையா? என காணவேண்டும்.

ஒற்று -அற்ற முனை படிவாக்கம்

இம்முறையில் நாம் விரும்பிய மரபணுவை, தொடரியெய் (Promoters) பொருந்து, நாம் விரும்பும் வழிகளில் (நேரான அல்லது தலைகீழ், orientation, sense or anti sense ) படிவாக்கம் செய்யலாம். இதற்கு இரு வேறு கட்டுள்ள நொதிகளால், பரப்பிகளும், படிவாக்க விரும்பும் டி.என்.எ வை செரிமானம் செய்யப்பட வேண்டும் . எ.கா. BamHI டி.என்.எ வின் ஒரு முனையின் 5'-G^G A T C C-3' (G G இடையிலும்), HindIII டி.என்.எ வின் மரு முனையின் 5'-A^A G C T T-3' (A A இடையில்) வெட்டுவதால், பிரிக்கப்படும் டி.என்.எ களின் சில இணைகள் (base pair) தனக்கு நேரெதிரான இணைகள் இல்லாமல் விடப்படும். இவைகளை ஒற்று-அற்ற முனை (sticky end) எனலாம். படிவாக்கம் செய்ய விரும்பும் மரபணுவும், இதே நொதிகளால் வெட்டப்படுவதால், மிக எளிதாக ஒற்று-அற்ற முனைகளில் இணையும். இரு நொதிகளும் அற்புதமாக செரிமானம் செய்து இருந்தால், இம்முறையில் தன்-இணைவு (self-ligation) குறைவாக அமையும்.

இந் நுட்பத்திற்கு எ. கோலி (E.coli) என்கிற நிலைகருவற்ற (Prokaryotes) உயிரினத்தில் வரும் பக்டிரியா பயன்படுத்தப்படும். மேலும் எ.கோலி பல சிறப்பு விடயங்களை தன்னகத்தே கொண்டுள்ளன.

• நோயைத் தூண்டுபவை அல்ல.
• ஒவ்வொரு இருபது நிமிடத்திற்கும் இரு கலங்கலாக பெருகும் தன்மை.
• எளிதாக கையாளும் தன்மை
• வளர்ப்பதில் எளிமை (மிகையான முதலீடுகள் இல்லை)

தேவையான பொருள்களும் உள் -முறைகளும்

• மாற்றப்பட்ட எ.கோலி கலங்கள் (Competent cells)
• தேர்ந்தெடுக்கும் மருந்து (selectable antibiotics)
• பாக்டீரியா வளர்ப்பூடகம் (Bacterial media)
• படிவாக்கம் செய்யும் பரப்பி (Vector)
• படிவாக்கம் செய்யப்படும் டி.என்.எ (DNA Insert)

மாற்றப்பட்ட எ.கோலி கலங்கள்

கால்சியம் குளோரைட் என்ற வேதி பொருளால் எ.கோலி கலங்கள் இருமுறை கழுவப்படும். இவை அனைத்தும் வெப்பநிலை 4C (பனிக்கட்டி) செய்யப்படும். இதனால் எ.கோலி கலத்தின் சவ்வுகள் (membranes) மிருதுவாக்கப்பட்டு, நெளிவுகளோடு (flexibility) இருக்கும்.

தேர்ந்தெடுக்கும் மருந்து

இவைகள் பரப்பிகளை பொருந்து அமையும் (எ.கா. அம்பிசிலின், கனமைசின்)

படிவாக்கம் செய்யும் பரப்பி

பரப்பிகளில் படிவாக்க பரப்பி (Cloning vectors) என்றும், புரத மிகைப்படுத்துதல், இருவாழ் -பரப்பி என பல வகைகள் உள்ளன. பெரும்பாலான படிவாக்க பரப்பிகளில் LacZ என்ற மரபணு உள்ளதால், படிவாக்கம் செய்தபின், டி.என்.ஏ பரப்பிகளில் இணைக்கப்பட்டுள்ளதா? இல்லையா? என எளிதாக அறியலாம். ஏனெனில் டி.என்.எ இணைக்கப்பட்டு இருந்தால் வெள்ளை நிறத்திலும், இணைக்கப்படாமல் இருந்தால் நீல நிறத்தில் கலங்கள் வெளிப்படும் (blue, white selection). இவைகள் கட்டுள்ள நொதிகளால் (Restriction enzymes) ஒரு அல்லது இரு (Ex. HindIII or HindIII and BamHI) நொதிகளால் வெட்டப்பட்டு இருக்கும்.

படிவாக்கம் செய்யப்படும் டி.என்.எ

நேரடியாக பாலிமரசு தொடர் வினை முடிந்து வரும் டி.என்.எ பொருளாகவோ அல்லது இரு கட்டுள்ள நொதிகளால் வெட்டப்பட்டு, பிரித்தெடுக்கப்பட்ட டி.என்.எ வாக இருக்கும்.

இணைவு நொதி

இணைவு நொதி (DNA ligase) பரப்பிகளையும், டி.என்.எ வையும் இணைக்க கூடியது.இவைகள் இ.கோலி கலத்தில் அல்லது படிவாக்கம் செய்யப்பட்ட டி4 நுண்மத்தின் இணைவு நோதியேய் மரபு வரிசைகள் இருந்து பிரித்தெடுக்கப்படுகின்றன.இவைகள் முறையெய்

• இ.கோலி இணைவு நொதி -E.coli DNA ligase
• டி4 இணைவு நொதி - T4 DNA ligase

என அழைக்கப்படும்.

இ.கோலி இணைவு நொதி ஒற்று முனை (சமமான முனை) கொண்ட மரபு இழை வரிசைகளை இணைக்க முடியாது அல்லது அதனின் திறன் குறைவு என்பதால், பொதுவாக டி4 இணைவு நொதி அனைத்து வகையான படிவாக்கத்திற்கு பயன்படுத்தப்படுகிறது.

மேலும் படிவாக்கம் செய்யப்படும , டி.என்.எ வை எ.கோலி கலத்தில் உள்-தள்ளுவதற்கான உருமாற்றம் அல்லது உருபெயர்ப்பு (transformation) என்ற நுட்பமும் இவ்விடத்தில் பயன்படுத்தப்படும்.

படிவாக்கம் செய்ய வேண்டிய டி.என்.எ கள், பரப்பி மற்றும் இணைவு நொதி சேர்க்கப்பட்டு, வெப்பநிலை 4- 18 C இல், 2-14 மணி நேரங்கள் வைக்கப்படும்.பொதுவாக வெப்பநிலை உயரும் போது குறைவான நேரத்தையும் , குறைந்த வெப்பநிலையில் நீண்ட நேரமும் வைக்கப்படுகிறது. குறைந்த வெப்பநிலையில் நீண்ட நேரத்தில் வைக்கப்படும் (incubation) பொழுது, மிகையான அல்லது நேர்த்தியான முடிவுகள் (optimum results) பெறுவதற்கான வாய்ப்புகள் உள்ளன. பின் இவைகள் எ.கோலி கலங்களோடு கலந்து 30 நிமிடத்திற்கு பனிக்கட்டிகளில் நிறுத்தப்படும். அரை மணி நேரம் கழித்து, இக்கலவையெய் மிக துரிதமாக ( தீடிர்ரென) 42C வெப்பநிலைக்கு உயர்த்தப்படும் பொழுது, எ.கோலி சவ்வில் ஏற்படும் நெளிவுகளால் டி.என்.எ இணைக்கப்பட்ட பரப்பிகள் எ.கோலி உயிரணுக்குள் உள் ஊடுருவிவிடும்.

வளர்ப்பூடகங்களில் தேர்ந்தெடுக்கும் மருந்துகள் இடப்படுவதால், பரப்பிகள் உள் சென்ற உயிரணுக்கள் (கலங்கள்) மட்டுமே வளர்ரூக்கிகளில் வளர முடியும். ஏனெனில் பரப்பிகளில் உள்ள ஒரு குறிபிட்ட மரபணு, தேர்ந்தெடுக்கும் மருந்துகளில் விளைவுகளை எதிர்த்து வாழும் தனமையெய் எ.கோலி (உயிரணுக்கள்) கலங்களுக்கு அளிகின்றன. உள் சென்ற பரப்பிகளை பாலிமரசு தொடர் வினை மூலமோ அல்லது மற்ற நுட்பகளினால் (DNA sequencing, restriction digestion) உறுதிபடுத்தலாம்.

மேலோட்டமாக படிப்பதற்கு எளிமையாக இருந்தாலும், இந் நுட்பத்தில் பல சிக்கல்களை ஆய்வாளர்கள் நேர்கொள்வார்கள். மேலும் படிவாக்க திட்டமிடலை (cloning strategy) மூலக்கூறு உயிரியலை நன்றாக புரிந்தவர்கள் மட்டும் மேற்கொள்ள முடியும்.

கலைச்சொற்கள்

உள்-பிணைவு படிவாக்கம்-In-fusion cloning

கட்டுள்ள நொதி- restriction enzyme

ஒற்று முனை படிவாக்கம்- blunt end cloning

ஒற்று -அற்ற முனை படிவாக்கம்- sticky end cloning

தன்-இணைவு- self-ligation

உருமாற்றம் அல்லது உருபெயர்ப்பு- transformation