பாலிமரேசு தொடர் வினை: திருத்தங்களுக்கு இடையிலான வேறுபாடு

Browse history interactively

← முந்தைய வேறுபாடு அடுத்த வேறுபாடு →

உள்ளடக்கம் நீக்கப்பட்டது உள்ளடக்கம் சேர்க்கப்பட்டது

VisualWikitext

வரியுள்

14:47, 17 பெப்பிரவரி 2014 இல் நிலவும் திருத்தம்

படிமம்:Pcr machine.jpg

பாலிமரேசு தொடர் வினை நிகழும் கருவி - Eppendorf நிறுவனத்தின் கருவி

மூலக்கூற்று உயிரியலில் பாலிமரேசு தொடர் வினை (Polymerase chain reaction, PCR) தொழில்நுட்பத்தைத் பயன்படுத்தி, மரபு நூலிழையின் (DNA) குறிப்பிட்ட ஒரு சிறு பகுதியை பல்லாயிரக்கணக்கில் பெருக்க முடியும்.

பொதுவாக இவ்வினை முக்கியமான படிப்படியான மூன்று நிலைகளை கொண்டுள்ளது:

இயல்பிழத்தல் அல்லது பிரித்தல் (denaturation)
ஆற்றிப் பதப்படுத்தல் அல்லது சேர்த்தல் (Anneling)
நீட்டித்தல் (extension/elongation)

இவை தவிர இம் மூன்று படிகளுக்கும் முன்னராக ஒரு ஆரம்ப படிநிலையும், மூன்று படிகளுக்கும் பின்னரான இறுதி நீட்டித்தல், குறுகியகால சேமிப்புக்கான படிநிலைகளும் கருத்தில் கொள்ளப்படும். இதில் ஆரம்பப் படிநிலை நிறைவேறியதும், அடுத்து வரும் மூன்று படிநிலைகளும் மீண்டும் மீண்டும் பல தடவைகள் சுழற்சி முறையில் நிகழும். அப்போது மரபு நூலிழையின் குறிப்பிட்ட ஒரு பகுதி மட்டும் மீண்டும் மீண்டும் நகலெடுக்கப்பட்டு அதிகளவில் பெறப்படும். பின்னர் இறுதி நீட்சியின் பின்னர் அவை தேவைக்கேற்ப 4-15°செ யில் குறுகிய காலத்திற்கு, பாலிமரேசு தொடர் வினை நிகழ்ந்த கருவியினுள்ளேயே சேமிக்கப்படும்.

செய்முறைப் பொருட்கள்

பாலிமரேசு தொடர்வினைக்கான வரைபடம். (1) 94–96 °செ இல் பிரிப்பு (2) ~65 °செ இல் சேர்ப்பு (3) 72 °செ இல் நீட்டிப்பு. மேலேயுள்ளப் படத்தில் நான்கு சுழல்கள் காட்டப்பட்டுள்ளன. நீலக் கோடுகள் டி.என்.ஏ வார்ப்புருவைக் குறிக்கிறது. இதனுடன் முன்தொடர்கள் (சிவப்பு அம்புகள்) சேர்ந்து டி. என். ஏ பாலிமரேசு நொதியால் (வெளிர்ப்பச்சை வட்டங்கள்) நீட்சிக்கப்பட்டு டி.என்.ஏ குறுந்தொடர்கள் (பச்சைக் கோடுகள்) பெறப்படுகிறது. இத்தொடர்கள், பாலிமரேசு தொடர் வினைகள் தொடர்ந்து நடக்கும்போது முன்தொடர்களாக உபயோகிக்கப்படுகின்றன.

இவ்வினை நிகழ்வதற்கு பல்வேறு கூறுகளும், வினைப்பொருள்களும் தேவைப்படுகின்றன^[1]. அவை கீழே பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன:

நகலாக்கம் செய்யப்பட்டு, அதிகளவில் பெறப்பட வேண்டிய பகுதியை உள்ளடக்கிய மரபு நூலிழையின் வார்ப்புரு (DNA template).
இலக்கு மரபு நூலிழைப் பகுதியின் இரு இழைகளின் 3' (3 prime) முடிவுகளிலும் உள்ள தொடரிகளுக்கான, குறைநிரப்பு (complementary) தொடரிகளைக் கொண்ட இரு முன்தொடர்கள் (primers).
டி. என். ஏ பாலிமரேசு நொதி (DNA polymerase). இது en:Taq Polimerase ஆகவோ, அல்லது வேறு பாலிமரேசு ஆகவோ இருக்கலாம். இவை பொதுவாக 70°செ வெப்பநிலையில் தொழிற்படும் தன்மை கொண்டனவாக இருக்கும்.
அடினின், தயமின், சைட்டோசின், குவானின் போன்ற தாங்கிகளைக் கொண்ட, மரபு நூலிழையின் கட்டமைப்பு உறுப்புக்களான டி.என்.டி.பி க்கள் (dNTPs, Deoxyribo nucleoside triphosphates).
Mg²⁺ இருவலு நேர் அயனியைக் கொண்ட மெக்னீசியம் குளோரைடு (MgCl2) அல்லது மெக்னீசியம் சல்ஃபேட்டு (MgSo4)- . இவை நொதிகளைப் பொறுத்து வேறுபடும்.
கார, காடித் தன்மையை நிலை நிறுத்துவதன் மூலம் தாக்கம் நிகழுமிடத்தில் சிறப்பான தொழிற்பாட்டுக்கான வேதிச் சூழ்நிலையை வழங்குவதுடன், பாலிமரேசு நொதியை நிலையாக வைத்திருக்கவும் உதவும் காரக்காடி நிலைநிறுத்திக் (buffer) கரைசல்.

செயல்முறை

மரபு நூலிழையில் உள்ள குறிப்பிட்ட ஒரு பகுதியைப் பெருக்குவதற்கு இந்தத் தொழில்நுட்பம் உதவுகின்றது. இலக்குப் பகுதியானது பொதுவாக 0.1-10 கிலோ தாங்கிச் சோடிகளைக் (kilo base pairs - kb) கொண்டதாக இருக்கும். ஆனாலும் ஒரு சில தாக்கங்கள் 40 கிலோ தாங்கிச் சோடிகள் வரை பெருக்கும் தன்மை கொண்டன.^[2] குறிப்பிட்ட பகுதியின் பெருக்கமானது வழங்கப்படும் பொருட்களின் அளவில் தங்கியிருக்கும். செயற்பாட்டிற்குத் தேவையான அடிப்படைப் பொருட்கள் ஒரு வரம்பிற்குள் இருப்பதனால், செயற்பாடும் ஒரு நிலைக்குப் பின்னர் நின்றுவிடும்^[3].

இந்த செயல்முறையானது, மீண்டும் மீண்டும், மாறி மாறி வரும் வெப்பநிலை மாற்றங்களை உள்ளடக்கிய பல சுழற்சிகளைக் கொண்ட செயல்முறையாகும். பொதுவாக 20-40 சுழற்சிகளை உள்ளடக்கியதாக இருக்கும். முதலில் ஆரம்பப் படிநிலையொன்றில், உயர் வெப்பநிலையில் (>90°செ)சில நிமிடங்கள் வைத்திருக்கப்படும்.

பிரித்தல்

மரபு நூலிழை (DNA) ஏணியொன்றைச் முறுக்கி வைப்பது போன்ற இரட்டைச் சுருள் (double helix) வடிவ அமைப்பாகும். இந்த பிரித்தல் நிகழ்வின் போது, 94–96°செ வெப்பநிலையில் இரட்டைச்சுருளில் இருக்கும் இழைகள் ஒவ்வொன்றும் தனித்தனியாகப் பிரிக்கப்பட்டு இரு தனி இழைகளை உருவாக்கும். நகலாகப் பெருக்கிப் பெறப்பட வேண்டிய பகுதியிலுள்ள வேறுபட்ட தாங்கிகளின் (bases) விகிதத்தைப் பொறுத்து, இந்தப் படிநிலைக்கான வெப்பநிலையில் சிறிய வேறுபாடுகள் இருக்கும்.

சேர்த்தல்

இந்நிகழ்வில் பிரிக்கப்பட்ட மரபு நூலிழைகள் ஒவ்வொன்றின் முடிவுப் பகுதியில், அவற்றிற்கென உருவாக்கப்பட்ட முன்தொடர்கள் (primers) இணைந்து கொள்ளும். இந்த முன்தொடர்கள், குறிப்பிட்ட மரபு நூலிழையில் எந்தப் பகுதி அதிகளவில் பெறப்பட வேண்டுமோ அந்தப் பகுதியின் முடிவிலிருக்கும் நியூக்கிளியோட்டைட்டு தொடரியிலுள்ள (nucleotide sequence) தாங்கிகளுக்கு (bases) எதிரான தாங்கிகளைக் கொண்ட நியூக்கிளியோட்டைட்டு தொடரியைக் கொண்டதாக இருக்கும். இந்தத் தன்மையால் அவை மரபு நூலிழையில் இலகுவாக இணைந்து கொள்ள முடிகின்றது. இந்தத் தாக்கம் நிகழும் வெப்பநிலையானது முந்தொடர்களின் தன்மையில் தங்கியிருக்கும். அதாவது முந்தொடர்களிலுள்ள தாங்கிகளின் எண்ணிக்கை, வெவ்வேறு தாங்கிகளின் விகிதம் என்பவற்ரில் தங்கியிருக்கும்.

நீட்டித்தல்

இந்நிகழ்வில் மரபு நூலிழை பல்கி நகலாக பெருக்கப்படும் (Amplification). வெப்பநிலை 75–80°செ அமைக்கலாம். டி. என். ஏ. பாலிமரேசு நொதி உயர் வெப்பநிலையில் (எரிமலையில்) வாழும் பாக்டீரியாவிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்படுவதால், இந்நொதியின் செயற்பாடுகளுக்கு உகந்த வெப்பநிலை 75–80°செ ஆகும்^[4]^[5], குறைவான வெப்பநிலையில் இத்தகு பாலிமரேசு தொடர்வினைகள் சிறப்பாக நிகழ்வதில்லை.

பாலிமரேசு தொடர்வினை வகைகள்

தொகுப்பு (colony) பி.சி.ஆர்.
ஆர். டி. பி.சி.ஆர். (ஆர்.என்.எ வை நிரப்பு இரட்டை உட்கரு அமிலமாக (சி.டி.என்.எ) மாற்றும் நுட்பம்)
அளவாக்க பி.சி.ஆர் (quantification PCR) - இவ் நுட்பத்தால் மரபணு வெளிப்படுதலின் அளவுகளை காணலாம்.
எதிர்புரதப் பற்றுகை பி.சி.ஆர் (Immuno-captured PCR): இம்முறையில் எதிர்ப்பான்களைப் பயன்படுத்தி, டி.என்.எ களை பிடித்து, பல்கி பெருக்கி உபயோகப்படுத்தப்படுகிறது.
தலைகீழ் பி.சி.ஆர். இந் நுட்பம் வட்ட வடிவிலான டி.என்.எ களை பல்கி பெருக்க பயன்படுத்தப்படுகிறது. மேலும் இவ்வினையின் மூலம் முழு டி.என்.ஏ. தொடர்ச்சிகளைப் (sequences) பெறலாம்.

மேற்கோள்கள்

↑ Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. பன்னாட்டுத் தரப்புத்தக எண்:0-879-69576-5. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction
↑ S Cheng, C Fockler, W M Barnes, and R Higuchi (1994 June 7). "Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. NCBI. pp. 91(12): 5695–5699. பார்க்கப்பட்ட நாள் பெப்ரவரி 16, 2014. {{cite web}}: Check date values in: |accessdate= and |date= (help)CS1 maint: multiple names: authors list (link)
↑ Ana C. Carr and Sean D. Moore* (2012 May 31). "Robust Quantification of Polymerase Chain Reactions Using Global Fitting". PLoS One. NCBI. pp. 7(5). பார்க்கப்பட்ட நாள் பெப்ரவரி 16, 2014. {{cite web}}: Check date values in: |accessdate= and |date= (help)
↑ Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bacteriol 127 (3): 1550–1557. பப்மெட்:8432.
↑ Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH. (1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.". PCR Methods Appl. 2 (4): 275-87. பப்மெட்:8324500.

வார்ப்புரு:Link FA

[molecular_cloning-1] Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. பன்னாட்டுத் தரப்புத்தக எண்:0-879-69576-5. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction

[2] S Cheng, C Fockler, W M Barnes, and R Higuchi (1994 June 7). "Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. NCBI. pp. 91(12): 5695–5699. பார்க்கப்பட்ட நாள் பெப்ரவரி 16, 2014. {{cite web}}: Check date values in: |accessdate= and |date= (help)CS1 maint: multiple names: authors list (link)

[3] Ana C. Carr and Sean D. Moore* (2012 May 31). "Robust Quantification of Polymerase Chain Reactions Using Global Fitting". PLoS One. NCBI. pp. 7(5). பார்க்கப்பட்ட நாள் பெப்ரவரி 16, 2014. {{cite web}}: Check date values in: |accessdate= and |date= (help)

[Chien_et_al.-4] Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bacteriol 127 (3): 1550–1557. பப்மெட்:8432.

[Lawyer_et_al.-5] Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH. (1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.". PCR Methods Appl. 2 (4): 275-87. பப்மெட்:8324500.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

@@ வரிசை 21: / வரிசை 21: @@
 ==செயல்முறை==
-மரபு நூலிழையில் உள்ள குறிப்பிட்ட இரு பகுதியைப் பெருக்குவதற்கு இந்தத் தொழில்நுட்பம் உதவுகின்றது. இலக்குப் பகுதியானது பொதுவாக 0.1-10 கிலோ தாங்கிச் சோடிகளைக் (kilo base pairs - kb) கொண்டதாக இருக்கும். ஆனாலும் ஒரு சில தாக்கங்கள் 40 கிலோ தாங்கிச் சோடிகள் வரை பெருக்கும் தன்மை கொண்டன<ref>{{cite web | url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC44063/ | title=Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA | publisher=NCBI | work=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America | date=1994 June 7 | accessdate=பெப்ரவரி 16, 2014 | author=S Cheng, C Fockler, W M Barnes, and R Higuchi | pages=91(12): 5695–5699}}</ref> <br />. குறிப்பிட்ட பகுதியின் பெருக்கமானது வழங்கப்படும் பொருட்களின் அளவில் தங்கியிருக்கும். செயற்பாட்டிற்குத் தேவையான அடிப்படைப் பொருட்கள் ஒரு வரம்பிற்குள் இருப்பதனால், செயற்பாடும் ஒரு நிலைக்குப் பின்னர் நின்றுவிடும்<ref>{{cite web | url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3365123/ | title=Robust Quantification of Polymerase Chain Reactions Using Global Fitting | publisher=NCBI | work=PLoS One. | date=2012 May 31 | accessdate=பெப்ரவரி 16, 2014 | author=Ana C. Carr and Sean D. Moore* | pages=7(5)}}</ref>.
+மரபு நூலிழையில் உள்ள குறிப்பிட்ட ஒரு பகுதியைப் பெருக்குவதற்கு இந்தத் தொழில்நுட்பம் உதவுகின்றது. இலக்குப் பகுதியானது பொதுவாக 0.1-10 கிலோ தாங்கிச் சோடிகளைக் (kilo base pairs - kb) கொண்டதாக இருக்கும். ஆனாலும் ஒரு சில தாக்கங்கள் 40 கிலோ தாங்கிச் சோடிகள் வரை பெருக்கும் தன்மை கொண்டன.<ref>{{cite web | url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC44063/ | title=Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA | publisher=NCBI | work=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America | date=1994 June 7 | accessdate=பெப்ரவரி 16, 2014 | author=S Cheng, C Fockler, W M Barnes, and R Higuchi | pages=91(12): 5695–5699}}</ref>  குறிப்பிட்ட பகுதியின் பெருக்கமானது வழங்கப்படும் பொருட்களின் அளவில் தங்கியிருக்கும். செயற்பாட்டிற்குத் தேவையான அடிப்படைப் பொருட்கள் ஒரு வரம்பிற்குள் இருப்பதனால், செயற்பாடும் ஒரு நிலைக்குப் பின்னர் நின்றுவிடும்<ref>{{cite web | url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3365123/ | title=Robust Quantification of Polymerase Chain Reactions Using Global Fitting | publisher=NCBI | work=PLoS One. | date=2012 May 31 | accessdate=பெப்ரவரி 16, 2014 | author=Ana C. Carr and Sean D. Moore* | pages=7(5)}}</ref>.
 இந்த செயல்முறையானது, மீண்டும் மீண்டும், மாறி மாறி வரும் வெப்பநிலை மாற்றங்களை உள்ளடக்கிய பல சுழற்சிகளைக் கொண்ட செயல்முறையாகும். பொதுவாக 20-40 சுழற்சிகளை உள்ளடக்கியதாக இருக்கும். முதலில் ஆரம்பப் படிநிலையொன்றில், உயர் வெப்பநிலையில் (>90°செ)சில நிமிடங்கள் வைத்திருக்கப்படும்.